1925年7月廣州國民政府成立，任軍事委員會委員兼國民革命軍第一軍軍長。1926年國民黨“二大”上當選為中央執行委員，同年任廣州國民政府軍事委員會主席，6月任國民革命軍總司令，出師北伐。
值得一提的是在這年的3月20日，蔣介石為了同共產黨爭奪領導權製造了一樁目的在於打擊共產黨人的陰謀事件——中山艦事件。這次事件使全體共產黨員被迫退出第一軍，第一軍軍權被蔣介石所掌握，3名反蔣的蘇聯顧問也1924年，孫中山與時任黃埔軍校校長的蔣介石合影。
蔣介石陰謀打擊共產黨的一次不流血的政變演習。事件之後，毛澤東痛斥了蔣介石，兩人發生過一次爭吵。
5月28日，毛澤東辭去宣傳部代理部長職務。從此，毛澤東離開了國民黨中央宣傳部。離開之前，毛澤東最後一次出席國民黨中央常委會——6月1日的第三十次會議。那次常委會，到會者既有蔣介石，也有毛澤東。這一次，是毛澤東和蔣介石在1920年代的最後一次見面。
此後，毛澤東和蔣介石闊別19年後，才在重慶談判時握手，蔣介石在江西南昌指揮“圍剿”中國工農紅軍回叙 20年代同在廣州的那段最初歲月。此時早已人是物非，兩人的境遇也發生了很大的改變……
1927年，蔣介石發動四一二反革命政變，成立南京國民政府，任國民黨總裁，同年 8月下野，1928年 1月回南京，任國民政府主席兼陸海空軍總司令。
蔣介石對於中共，在四一二反革命政變之後，向來是一個“剿”字：對井岡山一次次“ 會剿”；對江西中央蘇區五次“圍剿”；紅軍被迫長征，來個前堵後截；紅軍到達陝北後，則來個“西北剿匪”。面對著日本的侵略，蔣介石的政策是“攘外必先安內”。因此當抗日戰爭爆發以後，蔣介石始終奉行不抵抗政策。眼看國土一日一日淪喪於日本侵略者的鐵蹄之下，中國共產黨很是痛心，於是決定想辦法逼迫蔣介石抗日。
毛澤東在1936年12月1日率領19位紅軍將領聯名給蔣介石寫了一封信。
介石先生台鑒：
去年八月以來，共產黨、蘇維埃與紅軍曾屢次向先生要求，停止內戰，一致抗日。自此主張發表後，全國各界不分黨派，一致響應。而先生始終孤行已意，先則下令“圍剿”，是以有去冬直羅鎮之役。今春紅軍東渡黃河，欲赴冀察前線，先生則又阻之於汾河流域。吾人因不願國防力量之無謂犧牲，率師西渡，別求抗日途徑，一面發表宣言，促先生之覺悟。數月來綏東情勢益危，吾人方謂先生將翻然變計，派遣大軍實行抗戰。孰意先生僅派出湯恩伯之八個團向綏東赴援，聊資點綴，而集胡宗南、關麟征、毛炳文、王均、何柱國、王以哲、董英斌、孫震、萬耀煌、楊虎臣、馬鴻逵、馬鴻賓、馬步芳、高桂滋、高雙成、李仙洲等260個團，其勢汹汹，大有非消滅抗日紅軍蕩平抗日蘇區不可之勢。吾人雖命令紅軍停止向先生之部隊進攻，步步退讓，竟不能回先生積恨之心。吾人為自衛計，為保存抗日軍隊與抗日根據地計，不得已而有十一月二十一日定邊山城堡之役。夫全國人民對日寇進攻何等憤恨，對綏遠抗日將士之援助何等熱烈，而先生則集全力於自相殘殺之內戰。然而西北各軍官佐士兵之心理如何，吾人身在戰陣知之甚悉，彼等之心與吾人之心並無二致，亟欲停止自殺之內戰，早上抗日之戰場。即如先生之嫡系號稱勁旅者，亦難逃山城堡之慘敗。所以者何，非該軍果不能戰，特不願中國人打中國人，寧願繳槍於紅軍耳。人心與軍心向背如此，先生何不清夜捫心一思其故耶？今者綏遠形勢日趨惡化，前線之守土軍隊為數甚微，長城抗戰與上海“一二八”之役前車可鑒。天下汹汹，為公一人。當前大計只須先生一言而決，今日停止內戰，明日紅軍與先生之西北“剿共”大軍，皆可立即從自相殘殺之內戰戰場，開赴抗日陣線，綏遠之國防力量，驟增數十倍。是則先生一念之轉，一心之發，而國仇可報，國土可保，失地可複，先生亦得為光榮之抗日英雄，圖諸淩煙，馨香百世，先生果何故而不出此耶？吾人敢以至誠，再一次地請求先生，當機立斷，允許吾人之救國要求，化敵為友，共同抗日，則不特吾人之幸，實全國全民族唯一之出路也。今日之事，抗日降日，二者擇一。徘徊歧途，將國為之毀，身為之奴，失通國之人心，遭千
秋之辱罵。吾人誠不願見天下後世之人聚而稱曰，亡中國者非他人，蔣介石也，而願天下後世之人，視先生為能及時改過救國救民之豪傑。語曰，過則勿憚改，又曰，放下屠刀，立地成佛。何去何從，願先生熟察之。寇深禍亟，言重心危，立馬陳詞，伫候明教。
一九三六年十二月一日
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